今天是：2023年08月28日
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蛋白質(zhì)磷酸化Western Blot修飾研究的新方法
Introduction
蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)于許多生物現(xiàn)象的引發(fā)是很必要的，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、泛素（ubiquitin）介導(dǎo)的蛋白降解等過(guò)程。特別是酪氨酸磷酸化，作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶活性調(diào)控的一種主要方式，通常通過(guò)引發(fā)蛋白質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)而介導(dǎo)生長(zhǎng)因子、荷爾蒙和細(xì)胞因子等對(duì)細(xì)胞膜上受體的信號(hào)調(diào)控。
然而，酪氨酸磷酸化在細(xì)胞的所有磷酸化修飾中所占的比例卻非常低。大概10%的細(xì)胞蛋白會(huì)受到磷酸化共價(jià)修飾，但每100次蛋白的磷酸化修飾中僅有1次酪氨酸基團(tuán)的修飾。與大部分細(xì)胞中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估計(jì)要低2000倍。正是由于細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的水平相當(dāng)?shù)?，才能保證細(xì)胞在內(nèi)外信號(hào)的刺激下，作出靈敏的反應(yīng)，所以研究酪氨酸的磷酸化對(duì)于細(xì)胞信號(hào)的調(diào)控和許多重要生物現(xiàn)象的研究具有極為重要的意義，而對(duì)發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)的識(shí)別及磷酸化位點(diǎn)的鑒定對(duì)揭示細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控和藥物的作用位點(diǎn)起到非常重要的作用。研究蛋白質(zhì)磷酸化的相關(guān)方法：
磷酸化Western Blot：
對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)科研來(lái)說(shuō)，抗酪氨酸磷酸化抗體的出現(xiàn)是一個(gè)意義重大的事件。在沒有抗酪氨酸磷酸化抗體之前，蛋白質(zhì)和酶的酪氨酸磷酸化只能通過(guò)非常危險(xiǎn)的并且很費(fèi)時(shí)的放射性實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。而利用抗酪氨酸磷酸化抗體，則可以通過(guò)Western Blot或其它免疫學(xué)方法輕松地檢測(cè)到磷酸化信號(hào)。常規(guī)的檢測(cè)方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗體在Western Blot上檢測(cè)內(nèi)源或外源表達(dá)的磷酸化蛋白。如果目標(biāo)蛋白的含量較低，也可利用免疫沉淀的方法先富集發(fā)生磷酸化的酪氨酸蛋白，再檢測(cè)目標(biāo)蛋白的水平?？估野彼崃姿峄贵w也常用于檢測(cè)在不同處理的條件下，細(xì)胞內(nèi)總的酪氨酸磷酸化水平的變化情況，作為許多細(xì)胞生物現(xiàn)象的一個(gè)重要指標(biāo)。
我們都知道如果需要檢測(cè)某一個(gè)目標(biāo)蛋白的某一特定位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)，可以選用該蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化特異性抗體。但由于我們研究的通常是新的磷酸化位點(diǎn)，或者這些蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化抗體效果不夠好，我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家自己制備過(guò)磷酸化抗體，就會(huì)知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的制備更加困難，而且浪費(fèi)大量寶貴時(shí)間?，F(xiàn)在國(guó)外的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)可以使用通用型的磷酸化抗體，只要巧妙的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，也可以達(dá)到同樣的檢測(cè)目的。以Yuan的文章為例，他們需要檢測(cè)BCR-ABL的磷酸化，但他們沒有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠子來(lái)免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通過(guò)Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗體（pan-phosphotyrosine）來(lái)鑒定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一組以Clemens為首的科學(xué)家，則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗體來(lái)檢測(cè)DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通過(guò)區(qū)分這些蛋白的分子量大小，來(lái)確認(rèn)相應(yīng)的磷酸化條帶的蛋白身份。
與做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要額外需要注意的事項(xiàng)：
首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，會(huì)被磷酸酶去磷酸化，所以在樣品制備和整個(gè)免疫檢測(cè)過(guò)程中，需要抑制或避免細(xì)胞內(nèi)源性和外源性的磷酸酶的干擾。針對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性的磷酸酶，我們?cè)跇悠分苽鋾r(shí)，需要在細(xì)胞裂解液中加入足量的并且是新鮮的磷酸酶抑制劑，如PhosphoSafe 系列。外源性的磷酸酶主要是由實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的其它試劑帶入的，比如我們要確保封閉劑中不含磷酸酶等。同時(shí)，樣品中或其它試劑中帶的細(xì)菌也會(huì)分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blot的另一個(gè)關(guān)鍵是要盡量使用清潔的新鮮的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝膠，并且最好在樣品制備完就立刻上樣，當(dāng)天完成SDS-PAGE和Western Blot 檢測(cè)。如果要使用同一塊Blot進(jìn)行全蛋白的免疫檢測(cè)，就需要先做磷酸化的檢測(cè)再做全蛋白的檢測(cè)，以盡量避免磷酸化信號(hào)的丟失，這點(diǎn)非常重要。
有一些實(shí)驗(yàn)是用Western Blot來(lái)驗(yàn)證一組磷酸化的多肽或蛋白的存在，這時(shí)候就需要使用的通用型磷酸化抗體。因?yàn)橥ㄓ眯土姿峄贵w，如4G10酪氨酸磷酸化抗體，具有廣泛的識(shí)別范圍，同時(shí)具有很好的磷酸化特異性，才不會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。
以Liu的研究為例，他們就使用了通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10和PY20，利用Western Blot技術(shù)來(lái)驗(yàn)證其通過(guò)多肽芯片篩選出的多肽結(jié)果。他們的實(shí)驗(yàn)室是這樣設(shè)計(jì)的，首先利用磷酸化酪氨酸的多肽芯片（phospho-tyrosine peptide array）來(lái)篩選與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的磷酸化多肽序列，然后對(duì)這些合成的多肽序列進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，利用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10和PY20檢測(cè)其磷酸化水平。他們發(fā)現(xiàn)不同的抗體具有很不一樣的識(shí)別特異性，如pTyr-Pro 序列能被某些SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而不被4G10和PY20識(shí)別。但就總體而言，通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體可以識(shí)別絕大多數(shù)的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的磷酸化多肽，特別是4G10抗體比PY20抗體能識(shí)別更多的磷酸化酪氨酸多肽。
磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（PhosphoProteomics）：
磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)類似，可以通過(guò)2D膠和質(zhì)譜MS鑒定出新的磷酸化蛋白和蛋白的新磷酸化位點(diǎn)。但是利用MS從磷酸化蛋白中檢測(cè)出磷酸化肽段會(huì)遇到許多問(wèn)題，這是由于樣品中大量的非磷酸化肽段的存在使磷酸化肽段的相對(duì)濃度降低造成的。大量的非磷酸化肽段會(huì)抑制MS對(duì)磷酸化肽段的檢測(cè)，因此必須采取額外的實(shí)驗(yàn)步驟在MS之前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。對(duì)此，抗磷酸化特異性抗體以及親和層析瓊脂糖珠子或柱子就能起到很好得到富集作用。特別是對(duì)于細(xì)胞中比例很低的酪氨酸磷酸化的研究來(lái)說(shuō)，富集的過(guò)程尤顯重要。目前，通用型的抗酪氨酸磷酸化（pan-phosphotyrosine）單克隆抗體4G10和PY20已被證明對(duì)尋找蛋白酪氨酸磷酸化位點(diǎn)起到很好的作用。除此以外，也有一些通用型的抗絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的抗體如4A4，也可用于MS之前富集絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的蛋白。
磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)類似，可以通過(guò)2D膠和質(zhì)譜MS鑒定出新的磷酸化蛋白和蛋白的新磷酸化位點(diǎn)。但是利用MS從磷酸化蛋白中檢測(cè)出磷酸化肽段會(huì)遇到許多問(wèn)題，這是由于樣品中大量的非磷酸化肽段的存在使磷酸化肽段的相對(duì)濃度降低造成的。大量的非磷酸化肽段會(huì)抑制MS對(duì)磷酸化肽段的檢測(cè)，因此必須采取額外的實(shí)驗(yàn)步驟在MS之前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。對(duì)此，抗磷酸化特異性抗體以及親和層析瓊脂糖珠子或柱子就能起到很好得到富集作用。特別是對(duì)于細(xì)胞中比例很低的酪氨酸磷酸化的研究來(lái)說(shuō)，富集的過(guò)程尤顯重要。目前，通用型的抗酪氨酸磷酸化（pan-phosphotyrosine）單克隆抗體4G10和PY20已被證明對(duì)尋找蛋白酪氨酸磷酸化位點(diǎn)起到很好的作用。除此以外，也有一些通用型的抗絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的抗體如4A4，也可用于MS之前富集絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的蛋白。
Guha研究組就是利用這種方法來(lái)研究EGFR和KRAS的磷酸化水平變化的。
在肺腺癌（lung adenocarcinoma）病人中，原癌基因EGFR和KRAS是兩個(gè)最經(jīng)常發(fā)生突變的基因。但是帶有EGFR不同的突變或帶有KRAS的突變的病人，對(duì)TKI治療法（酪氨酸激酶抑制劑治療法）有不同的治療效果。Guha等人通過(guò)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來(lái)比較帶這些不同突變的病人的磷酸化蛋白的情況，揭示這些突變的細(xì)胞內(nèi)EGFR和KRAS的下游信號(hào)通路的變化，從而揭示了解造成TKI治療不敏感的機(jī)理。
首先，Guha等人使用了偶聯(lián)了抗酪氨酸磷酸化抗體的瓊脂糖珠子（4G10-agarose），對(duì)帶有不同突變的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀。通過(guò)這一步，可以對(duì)發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白以及與這些磷酸化蛋白緊密結(jié)合的其它蛋白進(jìn)行有效的富集。免疫沉淀的蛋白可以被100mM的磷酸苯酯洗脫出來(lái)，然后進(jìn)行透析，為下一步跑膠做去除過(guò)多的鹽分和離子的準(zhǔn)備。其實(shí)，透析很費(fèi)時(shí)間，而且蛋白樣品甚至?xí)幌♂?，可以選擇使用超濾離心（Amicon Ultra）的方法用半小時(shí)就可去除離子同時(shí)濃縮樣品。接下來(lái)，處理好的磷酸化蛋白樣品通過(guò)SDS-PAGE 膠分開后，進(jìn)行質(zhì)譜分析前的常規(guī)處理，包括使用Coomassie 染料進(jìn)行染色，把膠切成20-30塊小塊，胰酶消化成多肽片段等。通過(guò)LC-MS\MS，即可定性和定量的分析發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白以及與這些磷酸化蛋白緊密結(jié)合的其它蛋白。已被鑒別出的這些蛋白，可以用Western blot的方法，并結(jié)合使用特異性蛋白抗體和4G10抗體，對(duì)這些蛋白的酪氨酸磷酸化狀態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。
Lind等人的研究也利用了類似的方法，在做質(zhì)譜分析之前，使用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體來(lái)富集磷酸化蛋白或肽段。有趣的是，他們與前面提到的Liu的文章有一致的發(fā)現(xiàn)，在文中使用的5種酪氨酸磷酸化抗體中，使用4G10抗體富集的MS結(jié)果最后識(shí)別了最多的潛在酪氨酸磷酸化蛋白。
除了這種磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的通用方法以外，現(xiàn)在也出現(xiàn)了創(chuàng)新的方法來(lái)幫助研究磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)。其中基于Luminex xMAP和Epitome的Epiquant技術(shù)，就實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種蛋白的磷酸化和同一蛋白上的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)以及全蛋白，同時(shí)進(jìn)行高通量地定量檢測(cè)?？紤]到同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)細(xì)胞上，同一條Pathway上、下游蛋白的協(xié)同作用，可使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行研究。
蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性分析：
酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶（PTK）誘導(dǎo)。PTK有很多的種類，包括跨膜的和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性的酶。PTK在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用，其中包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和新陳代謝等。許多疾病也與某些PTK失調(diào)密切相關(guān)，比如造血系統(tǒng)的惡性腫瘤、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌等多種癌癥以及糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等。因此，對(duì)于PTK的活性分析也是細(xì)胞調(diào)控研究和藥物研發(fā)中常常需要進(jìn)行的研究。通過(guò)PTK的活性分析可以篩選PTK抑制劑，并可以獲得這些抑制劑的IC50參數(shù)。
PTK的活性分析最傳統(tǒng)的方法就是使用同位素的PTK的活性分析，后來(lái)也有多種非放射性的較安全的分析方法，例如，有基于ELISA的PTK活性分析，其中應(yīng)用了可以被許多PTK磷酸化的隨機(jī)多肽序列和HRP偶聯(lián)的抗酪氨酸磷酸化的特異性抗體。也有基于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的熒光偏振的分析方法?，F(xiàn)在，更有基于HTRF (homogenous time-resolved fluorescence) 的全新的PTK活性分析方法。這種方法利用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的原理，比基于ELISA和基于熒光偏振的方法更靈敏，信號(hào)也更穩(wěn)定，對(duì)于需要一段時(shí)間孵育的激酶分析來(lái)說(shuō)會(huì)更有優(yōu)勢(shì)。以通用型的4G10 HTRF分析為例，它使用了偶聯(lián)于Europium的工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體4G10，生物素標(biāo)記的酪氨酸多肽底物，和APC標(biāo)記的鏈霉素等。只要在體系中加入PTK激酶后，若多肽底物發(fā)生磷酸化，則此底物能被4G10抗體結(jié)合，導(dǎo)致熒光染料APC和Europium的距離很近足以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，激酶的活性越強(qiáng)則HTRF信號(hào)的加強(qiáng)越顯著（實(shí)驗(yàn)原理見下圖）
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